石蜡切片制作方法

发布 2019-08-07 18:51:55 阅读 7067

石蜡切片。

用途:1.研究植物组织内部结构;

2.原位杂交,揭示基因在植物体的表达部位或者特定的发育时期;

3.组织化学,显示细胞内的某些化学成分(核酸,多糖,淀粉,脂肪,木质素等)。

制作步骤:day1 取样固定。

faa固定液固定:真空抽气30min,室温下24h,4℃存储。

目的:保持细胞组织在活体状态下的成分和结构。

1. faa配方(1l):****100ml,乙酸30ml,50%乙醇870ml;

2. 固定用的容器:青霉素小瓶,10ml离心管,蓝盖瓶等。

day2 脱水。

切片材料脱水:除去组织内的水分,使细胞组织变硬,也便于透明剂进入细胞内。

30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇,各1.5h。材料在70%乙醇中过夜或者4℃长期保存。

day3 继续脱水、透明、透蜡。

1. 70%乙醇中过夜的材料继续脱水; 85%(1.5h)→95%(1.5h)→100%(1h)→100%(1h) 为了使材料脱水彻底,纯乙醇要换2次,每次1h。

2. 透明:使透明剂二甲苯进入组织内,以便使石蜡透入组织。

1/5二甲苯+4/5乙醇(1h)→2/5二甲苯+3/5乙醇(1h)→3/5二甲苯+2/5乙醇(1h)→4/5二甲苯+1/5乙醇(1h)→纯二甲苯(1h)→纯二甲苯(1h)。在装有材料的小瓶上画5格刻度线,每次吸取一格加入二甲苯,直至纯二甲苯。

3. 透蜡:透蜡注意从低浓度到高浓度,从低温到高温,使石蜡慢慢透入组织中,透蜡过程逐步升温 37℃→42℃→58℃(可不用)。

【将二甲苯吸出,仅剩没过材料的二甲苯,加入碎蜡至瓶满,碎蜡一完全融化,再加入碎蜡,直至瓶满。】

透蜡持续三天。

day7 纯蜡透蜡、包埋。

1. 换用纯蜡继续透蜡,换纯蜡3次,每次2h,包埋。(此处在60℃--65℃恒温中进行,依蜡熔点而确定)。

此时要换入液体状纯蜡,先将固体纯蜡在烧杯中80℃水浴或者用电炉烧开水使其熔化,然后放到60℃--65℃恒温箱中备用。

2. 包埋:使用包埋机进行, 叠小盒子并作标记,将纸盒注入适量的蜡(依材料大小而定)。然后转至包埋机的冷冻台上,待小盒底部已有一层蜡固定时,加入材料并摆放好位置。

day8 载玻片处理。

盖玻片、载玻片经洗洁精清洗或者10%盐酸泡过夜后,浸泡于95%乙醇中,晾干,将1mg/ml的多聚赖氨酸(pll)稀释成终浓度0.1mg/ml (10ml母液加90ml的蒸馏水);在染缸内用pll(粘片)处理载玻片20—30min; 取出晾干,装入盒内4℃保存。

day9:切片、展片、粘片。

切片前先修整蜡块,先将蜡块削成梯形,便于底部与蜡块相接,材料周围留1-2mm蜡。

1.利用半自动轮转切片机制作切片,调整好蜡块定位器与切片定位器之间的距离,设置切片厚度(8—10μm)。

2.旋转手柄,选取理想材料的切片迅速放入tk-218型恒温摊片烤片机的摊片水盘中,摊片机温度设置均为39-40℃。

注意:由于温度较高且材料较大,切片易卷曲,摊片时易出现褶皱,摊片动作要迅速;切片蜡带有纵痕现象,很可能是刀上粘有小碎蜡,可取下刀片用二甲苯擦拭。切片前可将修好的蜡块放在冰上,有助于形成蜡带。

切片卷曲是可调整刀片的角度。

3待蜡片在水中完全展开后,用多聚赖氨酸处理过的载玻片从水中慢慢捞出蜡带,使其平展在玻片上,置于烘片栏上烘干(水滴烘干),37℃烘箱中烘片48h。(可根据材料调整烘片的时间)。

day12 染色、 封片。

染色目的:根据观察的部位及目的,使用相对应的染液,使植物组织染上颜色,以区分开来,便于观察。

最常用的染液:苏木精(核,质染料)

染色前将染液配好,苏木精需要一段时间的成熟过程,所以可以提前2-4周配好,用纱布包好瓶口,放在通风处。成熟后放在棕色瓶避光保存。使用时以原液一份(150-200ml)加入50%乙醇(150ml)与乙酸(150ml)混合。

染液可**利用多次。

脱蜡→复水(各级乙醇,高→低)→染色→脱水→透明→封片。

封片:树胶封片,并盖上盖玻片,晾干,可长期保存。

石蜡切片制作

6.固定蜡块 将纸盒拆去,用刀片将有几个组织样的大蜡块修成只带一个组织样的四方小蜡块。将木块有槽的一面滴上少许蜡,迅速粘住蜡块,粘牢后松手,蜡块制作完成。7.切片 将蜡块上下两面修成平行面,固定于切片机上,与切片刀调成平行,摇动把手,切成蜡带,选择有完整组织样的蜡带使用。8.贴片 将蜡带光滑面向下,...

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